Metabolic engineering and regulation of secondary metabolites in plants
編輯：謝祥文、陳盈瑄、楊凱文
演講者 陳賢明 助理教授 臺灣大學植物科學研究所
主持人 黃榮南 教授 國立臺灣大學昆蟲學系
大綱 & 新知
這次邀請到本校植物科學研究所陳賢明助理教授蒞臨演講，演講主軸為植物次級代謝物的生合成、訊號傳遞與其在植物中的基因調控機制。植物的初級代謝物為蛋白質、氨基酸及醣類等，作為植物生長發育使用；而次級代謝物則是由初級代謝物衍生而成的有機化合物，當植物面臨到生物性或非生物性等逆境時，可利用次級代謝物作為防禦及競爭的武器。植物可利用有毒物質(次級代謝物)對抗蟲和病的危害，trichome即是植物特化來用來儲存這些有毒物質的構造。野外的番茄較栽培種更能抵抗生物性逆境，就是因為具有較多的trichome，因此儲存的次級代謝物也較多。有趣的是，不同物種的trichome不盡相同，很可能是為了儲存不同的化合物而特化的，而不同植物產生的化合物很可能會對另一種植物造成毒害。
2015年諾貝爾生醫獎得主屠呦呦，發現了如何從黃花蒿 (Artemisia annua)中萃取青蒿素 (Artemisinin，一種由5碳的IDP及DMAPP所組成的Terpene類次級代謝物)，來達到抗瘧疾的用途。植物中次級化合物的產量非常的少，如果可以大量生產，將對位處瘧疾高風險區的發展中國家之疾病控制有很大的助益。然而傳統方法能萃取到的量極少，因此科學家想利用細菌和微生物進行基因工程操作，來生合成大量的青蒿素。其生合成途徑首先由第一個酵素amorphdiene synthase (ADS) 將farnesyl pyrophosphate (FPP) 轉換成amorphadiene (AD)，再由另一個酵素amorphadiene oxidase (AMO) 參與三個步驟，從AD轉換成artemisinic alcohol (AAOH)，轉換成artemisinic aldehyde (AAA)，再到artemisinic acid (AA)，接著則需要DBR2跟ALD1來轉換成最接近他的前驅物dihydroartemisinic acid (DHAA)。在自然界中黃花蒿有兩種chemotype，在HAP (high artemisinin production) 的chemotype中有很多的前驅物DHAA，和很多的終產物artemisinin；而另一種LAP (low artemisinin production) 的chemotype，則大部分是形成artemisinic acid和arteannuin B (AB)。
經實驗後發現，兩種chemotype的關鍵酵素ADS沒有顯著差異，但可以參與三個步驟的AMO卻有所不同，在LAP chemotype中的AMO，N端前面多了 7 個氨基酸，讓他的活性相對較強，才走向轉換成低青蒿素產物的AA和AB途徑，而非生產高青蒿素產物的DHAA及AN。在老師博士班時，他們想利用生物量更大的植物來生產青蒿素，並試著把這整套系統搬到圓葉菸草 (Nicotiana benthamiana) 上，但這個化合物對圓葉菸草具有毒性，造成葉子褐化、枯萎，甚至接近死亡，而檢測菸草時則發現許多的青蒿素前驅物已經進一步的修飾，可以讓化合物的毒性降低，但最終還是只能得到前驅物，無法產生終產物Artemisinin，推測可能是缺少了運輸機制。
這些很小的分子在細胞裡面應是疏水性、脂溶性的化合物，可能需要一些轉運蛋白才可以把它傳送到胞外，經實驗後也證明了LTP (lipid transfer protein) 確實參與了一些油滴的生合成途徑，並在上述的圓葉菸草系統中，再多加入兩個轉運相關的基因—PDR (pleiotropic drug resistance) 及LTP，但在第7天還是只能看到前驅物增加，沒有終產物artemisinin，後來是老師博士班畢業後，才由實驗室的學妹在第13天時檢測到artemisinin！這個故事告訴我們，實驗失敗可能不是真的失敗，也許換個方法，就可以找到你要的東西！
而後又推測vesicle也可能參與了terpene的運輸，v-SNARE及t-SNARE這兩個蛋白質就是參與這些囊泡的生合成。於是使用RNAi試著阻斷這兩個基因並同時和terpene synthase大量表現在植物中，原本預測terpene的產量會因囊泡的生合成受阻而降低，結果發現terpene產量卻增高了五倍。經NGS定序分析後，發現原來是小分子攻擊了proteasome，terpene synthase無法被降解，產量才會反而增加！發現實驗不如預期時也不要灰心，試著以不同方式尋求答案，總會有不同的收穫。
老師目前比較新的研究是有關聚乙炔 (Polyacetylenes)的生合成途徑。聚乙炔是長碳鏈的化合物，在植物中用來抗蟲、抗真菌及排他作用，在動物及人類中有抗發炎及抗菌的功效。大花咸豐草即是一個很好的研究聚乙炔生合成途徑的對象。根據前人研究，已知主要有FAD2及FAD2-like相關的基因參與了聚乙炔的生合成途徑。於是，於大花咸豐草中，將BpOD及BpFAA兩基因進行RNAi的處理，也透過VOX (virus-mediated gene overexpression) 來大量表現BpOD及BpFAA，確認BpOD及BpFAA參與了大花咸豐草中聚乙炔的生合成途徑。
最後老師分享了次級代謝物在植物體內的訊號傳遞相關研究，例如在十字花科植物(如阿拉伯芥)被蟲咬時，細胞裡的水解酶會被釋出，水解游離在細胞中的glucosinolates (硫代葡萄糖苷)，產生有毒物質，即可用來進行防禦。利用阿拉伯芥在訊號傳遞上的各種變異株，即可一一測試哪種變異株對硫代葡萄糖苷水解產物(glucosinolates hydrolysis product, GHP)不會發生毒害，即可推測此訊號傳遞參與其中。最後發現nia1nia2 (NO生合成缺失)突變株比較不會有毒害的現象，在此植株中GHP訊號無法傳遞，經定序分析後即可得知有哪些基因和wildtype不同，進而得知GHP在阿拉伯芥中訊號傳遞的全貌。另外，將阿拉伯芥進行低濃度的GHP處理後，亦可提高其對病原菌的抗性。
老師來不及跟大家分享目前實驗室另一些研究，包含綠豆與昆蟲的交互作用之研究，植物揮發性化合物(VOC)如何參與其中，希望日後能有機會聆聽這些研究的分享。
Q&A
Q1、昆蟲取食植物時植物會揮發次級代謝物，檢測這些次級代謝物時是不是需要次級代謝物的資料庫否則無法檢測?
A1、GC library裡關於氣態代謝物的資料齊全，通常比對到與資料庫相符合就是對的，如果還要再進一步確認，還是需要購買標準品進行檢測。
Q2、如果想要大量表現次級代謝物時，能不能大量培養植物的細胞來表現?
A2、有用trichome等特殊的絨毛細胞來大量表現，但過程操作比較複雜，而且也需要在特定環境下培養植物細胞，我們實驗室之前是以植物(圓葉煙草)來表現次級代謝物。
Q3、NGS可以讓我們得到系統裡的候選基因，但需要花很多時間檢測，要怎麼從NGS資料庫裡檢測出目標基因?
A3、次級代謝物會受到環境壓力影響表現，會先用JA treatment去檢測被影響的基因有哪些，去篩選掉一些不可能是目標的基因，最後再用RNAi等方法取篩選目標基因。
Q4、有甚麼平台或資料庫可以進行篩選或查詢基因交互關係?
A4、目前還是用模式生物如水稻等生物準確性比較高，且也有些免費軟體可使用。
Q5、有提到trichome和特別的植物代謝物，這些東西是會在植物特別的位子產生嗎?因為畫面上看起來外型幾乎都一樣。
A5、通常會長在植物莖和葉的表皮，其實外型上還是有點不一樣，如番茄有八種型態。植物代謝物的生合成基因在植物的表現位置不同，產物在trichome中生合成與儲存也不同。
Q6、抗蟲品系作物蟲不喜歡吃人也覺得不好吃，有沒有辦法找到有抗蟲功能且又好吃的作物?
A6、目前來說比較難做到，野生番茄超難吃，但這是一個非常好的資源去研究抗蟲抗病基因，科學家把抗蟲抗病基因進一步的透過育種導入到作物裡，透過分子技術篩選出好的品系。
Key words : 植物次級代謝物、生合成途徑、代謝工程及調控、訊號傳遞
花絮照片:
